HPLC ( High Performance Liquid Chromatography)

CDR II

HPLC ( High Performance Liquid Chromatography)

HPLC ( HighPerformance Liquid Chromatography)

HPLC( High Performance Liquid Chromatography)

• Pada prinsipnya kerja HPLC adalah sama yaitu pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya.
• Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. 
• Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya dan kecepatannya untuk sampai kedektetor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spectrum yang puncak-puncaknya terpisah.
• Ukuran skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alcohol < golongan asam. 
• HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut dengan Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik. 

 

SISTEMPERALATAN HPLC 

Instrumentasi HPLCpada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkansampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak,dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistemkromatografi cair seperti ini : 

1.Wadah Fase gerak dan Fase gerak 

Wadahfase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labulaboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapatmenampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut(1). Fase gerak atau eluenbiasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secarakeseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi iniditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifatkomponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fasegerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak),kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. 

Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. 

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas. 

Fasegerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalahcampuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril.Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakanadalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasiatau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normalini kurang umum dibanding dengan fase terbalik. 

2. Pompa 

Pompayang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syaratsebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak.Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, danbatu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuktujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengankecepatan 20 mL/menit. 

Tujuanpenggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjaminproses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan,dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengantekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompadengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengantipe pompa dengan tekanan konstan.

3. Tempat penyuntikan sampel 

Sampel-sampelcair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalirdi bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat daritembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel(sample loop) internal atau eksternal.

         Posisi pada saat memuat sampel                                       Posisi pada saat menyuntik sampel

4. Kolom dan Fase diam 

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:

1. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit). 
2. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis. 

Meskipun demikian,dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dankurang bermanfaat untuk analisis rutin. 

Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).  

Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain. Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi.

Oktil atau rantaialkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silikaaminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocoksebagai pengganti silika yangtidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan wakturetensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.

5. Detektor HPLC 

Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor  ndeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia. 

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut: 

1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.
2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil. 
3. Stabil dalam pengopersiannya.
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita. 
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Beberapadetektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik detektorseperti berikut :

JENISHPLC

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.

Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkanberdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, denganjenis-jenis HPLC sebagai berikut: 

1. Kromatografi Adsorbsi

Prinsip kromatografi adsorpsitelah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapistipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal denganmenggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografiini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugushidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silikamempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuatsehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor. 

2. Kromatografi fase terikat 

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. 

Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air ataudengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah,peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solutakan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasiini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jikasolut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yangmengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat. 

3. Kromatografi penukar ion 

KCKTpenukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengansuatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipundemikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. 

Kebanyakanpemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifationisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkoholdan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air,retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik sertaoleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensisolut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing denganion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ion. 

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampelionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion.Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan. 

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran. 

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografipermiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawadengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupasilika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus(lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yangmempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudianmolekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebihkecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akantetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahandengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fasediam seperti tipe kromatografi yang lain. 

6. Kromatografi Afinitas. 

Dalam kasusini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangatspesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerapsampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentupada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen danantibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein(enzim) dari campuran yang sangat kompleks. 

DERIVATISASI PADA HPLC 

Derivatisasimelibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen untukmengubah sifat fisika-kimia suatu analit. 

Tujuan utama penggunaan derivatisasi pada HPLC adalah untuk:

1. Meningkatkan deteksi;
2. Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan puncak kromatografi yang lebih baik;
3. Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik;
4. Menstabilkananalit yang sensitif. 

Detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLCadalah detektor UV-Vis sehingga banyak metode yang dikembangkan untuk memasangatau menambahkan gugus kromofor yang akan menyerap cahaya pada panjanggelombang tertentu. Di samping itu, juga dikembangkan suatu metode untukmenghasilkan fluorofor (senyawa yang mampu berfluoresensi) sehingga dapatdideteksi dengan fluorometri. 

Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyaisyarat-syarat sebagai berikut, yakni: produk yang dihasilkan harus mampumenyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senyawaberfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri; prosesderivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100 %);produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi;serta sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidak menganggu pemisahankromatografi. 

 

Berbagai macam bahan penderivat telah tersedia antara lain : 

Derivatisasiini dapat dilakukan sebelum analit memasuki kolom (pre-column derivatization)atau setelah analit keluar dari kolom (post-column derivatization).