KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)

CDR II

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT) 

Pengertian Kromatografi Lapis Tipis (KLT) 

Kromatografi adalah suatu teknikpemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diferensial dinamis dalamsistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergeraksecara berkesinambungan dalam arah tertentu dan di dalamnya zat-zat itumenunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya pembedaan dalam adsorpsi,partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul, atau kerapatan muatan ion.Atau secara sederhana kromatografi biasanya juga di artikan sebagai teknikpemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalammedium tertentu. Kromatografi di gunakan untuk memisahkan substansi campuranmenjadi komponen-komponen. Seluruh bentuk kromatografi bekerja berdasarkanprinsip ini. 

Kromatografi lapis tipis merupakansalah satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang ingin di deteksi denganmemisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran.Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan fisika-kimia dengan fase gerak(larutan pengembang yang cocok), dan fase diam (bahan berbutir) yang diletakkanpada penyangga berupa plat gelas atau lapisan yang cocok. Pemisahan terjadiselama perambatan kapiler (pengembangan) lalu hasil pengembangan di deteksi.Zat yang memiliki kepolaran yang sama dengan fase diam akan cenderung tertahandan nilai Rf-nya paling kecil. Kromatografi lapis tipis digunakan untukmemisahkan komponen-komponen atas dasar perbedaan adsorpsi atau partisi olehfase diam di bawah gerakan pelarut pengembang. 

Pada identifikasi noda atau penampakan noda, jika noda sudah berwarnadapat langsung diperiksa dan ditentukan harga Rf. Rf merupakan nilaidari Jarak relative pada pelarut. Harga Rfdihitung sebagai jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jaraktempuh oleh eluen (fase gerak) untuk setiap senyawa Rf juga menyatakan derajatretensi suatu komponen dalam fase diam. Karena itu Rf  juga disebut factorreferensi.

Faktor-faktoryang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapisan tipis yang jugamempengaruhi harga Rf  adalah :

1. Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan. 
2. Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya. Biasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan menge­ringkan molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari penyerap. Perbedaan penyerap akan memberikan perbedaan yang besar terhadap harga  R_f meskipun menggunakan fase bergerak dan zat terlarut yang sama tetapi hasil akan dapat diulang dengan hasil yang sama,   jika menggunakan penyerap yang sama, ukuran partikel tetap  dan jika pengikat (kalau ada) dicampur hingga homogen. 
3. Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap. Pada prakteknya tebal lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu diusahakan tebal lapisan yang rata. Ketidakrataan akan menyebabkan aliran pelarut menjadi tak rata pula dalam daerah yang kecil dari plat. 
4. Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak. Kemurnian dari pelarut yang digunakan sebagai fase bergerak dalam kromatografi lapisan tipis adalah sangat penting dan bila campuran pelarut digunakan maka perbandingan yang dipakai harus betul-betul diperhatikan. 
5. Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan. 
6. Teknik percobaan. Arah pelarut bergerak di atas plat. (Metoda aliran penaikan yang hanya diperhatikan, karena cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran penurunan dan mendatar juga digunakan). 
7. Jumlah cuplikan yang digunakan. Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil penyebaran noda-noda dengan kemungkinan terben­tuknya ekor dan efek tak kesetimbangan lainnya, hingga akan mengakibatkan kesalahan-kesalahan pada harga-harga R_f. 
8. Suhu. Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini terutama untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh penguapan atau perubahan-perubahan fase. 
9. Kesetimbangan. Ternyatabahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih pen­ting dalam kromatografikertas, hingga perlu mengusahakan at­mosfer dalam bejana jenuh dengan uappelarut. Suatu gejala bila atmosfer dalam bejana tidak jenuh dengan uappelarut, bila digunakan pelarut campuran, akan terjadi pengembangan denganpermukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fase bergerak lebih cepat padabagian tepi-tepi  dan keadaan ini harusdicegah.  

Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, ataukombinasi cairan-padatan) dan fasegerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diamdan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponenyang berbeda bergerak pada laju yang berbeda. Sedangkanfase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansiyang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultra violet. Pendaran ini ditutupipada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercak-bercak itutidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Namun, apabila di sinarkandengan sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbedadengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap. Sementara UVtetap di sinarkan pada lempengan, harus dilakukan penandaan posisi-posisi daribercak-bercak dengan menggunakan pensil dan melingkari daerah bercak-bercakitu. Ketika sinar UV dimatikan, bercak-bercak tersebut tidak tampak kembali. 

Prinsip Kerja KLT 

Pada proses pemisahan dengan kromatografi lapis tipis, terjadi hubungankesetimbangan antara fase diam dan fase gerak, dimana ada interaksi antarapermukaan fase diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan diidentifikasiyang telah berinteraksi dengan fasa geraknya. Kesetimbangan ini dipengaruhioleh 3 faktor, yaitu : kepolaran fase diam, kepolaran fase gerak, sertakepolaran dan ukuran molekul. 

Padakromatografi lapis tipis, eluent adalahfase gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed)untuk melewati fase diam (adsorbent). Interaksi antara adsorbent denganeluent sangat menentukanterjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab itu pemisahan komponen secara  kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent dan jumlah umpan. Eluent dapat digolongkan menurutukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau campuran pelarut tersebut padaadsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah jenis  adsorben alumina atau sebuah lapis tipissilika. Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusirpelarut yang tak polar dari ikatannya dengan alumina (gel silika). Semakindekat kepolaran antara senyawa dengan eluen maka senyawa akan semakin terbawaoleh fase gerak tersebut. Hal ini berdasarkan prinsip “like dissolved like”.

Fase Diam dan Fase Gerak KLT 

 Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buahfase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuransedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudahtertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larutdalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, ataukombinasi cairan-padatan) dan fasegerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fasediam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran.Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda.

Fase Diam 

Pelaksanaan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silikagel atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastikyang keras. Gel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untukkromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapatberpendar flour dalam sinar ultra violet. Fase diam lainnya yang biasadigunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan jugamemiliki gugus -OH.

Fase Gerak 

Dalam kromatografi, eluent adalahfase gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed)untuk melewati fase diam (adsorbent). Interaksi antara adsorbent denganeluent sangat menentukanterjadinya pemisahan komponen.

Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Penggolongan ini dikenal sebagai deret eluotropik pelarut. Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang relatif tak polar dari ikatannya dengan alumina (gel silika). 
Kecepatan gerak senyawa-senyawa ke atas pada lempengan tergantung pada: Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut, Hal ini bergantung pada bagaimana besar atraksiantara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.

Kelebihan Metode Kromatografi Lapis Tipis

Beberapa keuntungan dari kromatografi lapis tipis ini adalah sebagai berikut :

1. Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis. 
2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet. 
3. Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi. 
4. Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang dengan metode kertas tidak bisa 
5. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak. 
6. Hanya membutuhkan sedikit pelarut. 
7. Waktu analisis yang singkat (15-60 menit) 
8. Investasi yang kecil untuk perlengkapan (Biaya yang dibutuhkan ringan). 
9. Preparasi sample yang mudah 
10. Kemungkinan hasil palsu yang disebabkan oleh komponen sekunder tidak mungkin 
11. Kebutuhan ruangan minimum

Analisis KLT banyak digunakan karena :

1. Waktu yang diperlukan untuk analisis senyawa relatif pendek 
2. Dalam analisis kualitatif dapat memberikan informasi semi kuantitatif tentang konstituen utama dalam sampel 
3. Cocok untuk memonitor identitas dan kemurnian sampel 
4. Denganbantuan prosedur pemisahan yang sesuai, dapat digunakan untuk analisiskombinasi sampel terutama dari sediaan herbal.

Faktor Retensi 

Faktorretensi (Rf) adalah jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak yangditempuh oleh eluen. Rumus faktor retensi adalah NilaiRf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen tertentu. Haltersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan senyawa dalamsampel. Senyawa yang mempunyai Rf lebih besar berarti mempunyai kepolaran yangrendah, begitu juga sebaliknya. Hal tersebut dikarenakan fasa diam bersifatpolar. Senyawa yang lebih polar akan tertahan kuat pada fasa diam, sehinggamenghasilkan nilai Rf yang rendah. 

RfKLT yang bagus berkisar antara 0,2 - 0,8. Jika Rf terlalu tinggi, yang harusdilakukan adalah mengurangi kepolaran eluen, dan sebaliknya.

 Cara Menggunakan KLT 

KLTsangat berguna untuk mengetahui jumlah komponen dalam sampel. Peralatan yangdigunakan untuk KLT adalah chamber (wadah untuk proses KLT) , pinset,plat KLT, dan eluen. Inilah langkah-langkah memakai KLT:

1. Potong plat sesuai ukuran. Biasanya, untuk satu spot menggunakan plat selebar 1 cm. Berarti jika menguji 3 sampel (3 spot) berarti menggunakan plat selebar 3 cm. 
2. Buat garis dasar (base line) di bagian bawah, sekitar 0,5 cm dari ujung bawah plat, dan garis akhir di bagian atas. 
3. Menggunakan pipa kapiler, totolkan sampel cairan yang telah disiapkan sejajar, tepat di atas base line. Jika sampel padat, larutkan pada pelarut tertentu. Keringkan totolan. 
4. Dengan pipet yang berbeda, masukkan masing-masing eluen ke dalam chamber dan campurkan. 
5. Tempatkan plat pada chamber berisi eluen. Base line jangan sampai tercelup oleh ulen. Tutuplah chamber. 
6. Tunggu eluen mengelusi sampel sampai mencapai garis akhir, di sana pemisahan akan terlihat. 
7. Setelah mencapai garis akhir,angkat plat dengan pinset, keringkan dan ukur jarak spot. Jika spot tidakkelihatan, amati pada lampu UV. Jika masih tak terlihat, semprot dengan pewarnatertentu seperti kalium kromat atau ninhidrin. 

 

Pelaksanaan KLT

1. Fase Diam

Fase diam yangdigunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 μm. Semakin kecilukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fasediam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya.

Penjerap yangpaling sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi yangutama pada KLT adalah adsorpsi danpartisi (Gandjar &Rohman, 2007).

2. Fase Gerak

Fase gerak padaKLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-coba karenawaktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialahcampuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapatmudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal.Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak :

• Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknik yang sensitif. 
• Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan. 
• Untuk pemisahandengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatanmigrasi solut yang berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yangbersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar sepertimetil benzene akan meningkatkan harga Rf secara signifikan (Gandjar & Rohman,2007). 
• 
  

  
  
  Tabel 2.1.     Beberapa Sistem Pemisahan dengan KLT dari Bahan Alam (Gibbons, 2006)
  
  
  
  
  
  
   

3. Penotolan Sampel 

Untukmemperoleh roprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5 μl.Jika volume sampel yang ditotolkan lebih besar dari 2-10 μl, maka penotolanharus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan(Gandjar & Rohman, 2007).  

4. Pengembangan. 

Bilasampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan sampeldalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan uap fase gerak.Tepi bagian bawah lempeng tipis yang telah ditotoli sampel dicelupkan kedalamfase gerak kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak dalam bejana harus dibawahlempeng yang telah berisi totolan sampel. 

Bejanakromatografi harus tertutup rapat dan sedapat mungkin volume fase gerak sedikitmungkin, akan tetapiharus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian lempeng yang telah ditentukan.Untuk melakukan penjenuhan fase gerak, biasanya bejana dilapisi dengan kertassaring. Jika fase gerak telah mencapai ujung dari kertas saring, maka dapatdikatakan bahwa fase gerak telah jenuh (Gandjar & Rohman, 2007).

5. Deteksi Bercak

Deteksi bercakpada KLT dapat dilakukan secara kimia dan fisika. Cara kimia yang biasadigunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui carapenyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakanuntuk menampakkan bercak adalah dengan cara pencacahan radioaktif danfluorosensi sinar ultraviolet. Fluorosensi sinar ultraviolet terutama untuksenyawa yang dapat berfluorosensi, membuat bercak akan terlihat jelas (Gandjar& Rohman, 2007).

Deteksi senyawa dilakukan dengan menggunakan detektor UV di bawah sinar UV 254 nm, indikator pada plat KLT akan memancarkan warna hijau dan pada UV 366 nm akan memancarkan warna ungu. Komponen yang menyerap cahaya pada 254 atau 366 nm akan tampak sebagai bercak gelap pada plat yang bercahaya (Gibbons, 2006). Metode deteksi lain adalah dengan menggunakan pereaksi semprot. Pereaksi semprot yang umum digunakan dapat dilihat pada tabel 2.2.

Tabel 2.2. Beberapa Jenis Pereaksi Semprot untuk KLT (Gibbons, 2006)

AngkaRf berjangka antara 0,00 dan 1,00 dan hanya dapat ditentukan dua desimal.hRf  adalah angka Rf dikalikan faktor 100 (h), menghasilkan nilaiberjangka 0 – 100.